产品文档

转录调控

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档,已成为研究蛋白质相互作用的经典方法。

 

蛋白表达纯化实验

真核表达实验

真核表达是近年来常用的一种表达重组蛋白的手段,它补充了一些原核蛋白表达系统中所缺乏的功能,例如真核表达时能够形成稳定的二硫键,在蛋白经过翻译后可对蛋白进行正确修饰,使表达出来的蛋白更具天然活性而不是被降解或者是形成包涵体;利用真核表达系统可以诱导高效表达,加快了人们对基因研究以及药物研究的进程。

哺乳动物细胞系统是真核表达系统中唯一可以表达复杂蛋白的系统,它能够指导真核表达蛋白进行正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能,所以它和昆虫酵母系统比较更具有发展潜力,哺乳动物细胞真核表达的蛋白与天然真核表达蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高也一定程度上减缓了它的发展速度。哺乳动物细胞表达系统主要是通过改造宿主细胞来提高外源蛋白的表达效率,常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、SP2 /0N 等,哺乳动物转染方法,有脂质体转染法,电穿孔法以及病毒转染等。

酵母表达系统的遗传背景清楚,操作较为简便,容易进行遗传操作,有较为完善的真核蛋白表达控制系统,在基因,遗传疾病研究中运用广泛,许多遗传性疾病的基因都和酵母基因有很高的同源性,研究酵母基因的编码以及其真核蛋白表达的蛋白可加深对这些疾病的了解。

原核表达

原核表达系统是通过原核生物来获得外源蛋白的体系,主要包括:大肠杆菌表达系统,枯草芽孢杆菌表达,链霉菌表达等,其中大肠杆菌表达系统最为广泛,一般所说的原核系统主要是指大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌蛋白表达原理:

原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列,且密集于染色体上,共同形成一个转录单位–操纵子,也称基因表达的协同单位,大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y 及A 三个结构基因,分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基转移酶(transacetylase);此外还有调控基因:操纵序列O(operator)、启动序列P(promoter);而I(编码Lac 阻遏物,Lac repressor)不属于乳糖操子,Lac阻遏物是一种具有4 个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。在没有乳糖存在时,Lac操纵子处于阻遏状态,Lac阻遏物能与操纵基因O结合,阻碍RNA 聚合酶与P 序列结合,阻止了转录的路径,从而抑制转录启动。而当有诱导剂(IPTG)存在时,诱导剂可与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白构象发生变化,导致阻遏物从操纵基因O 上解离下来,RNA 聚合酶不再受阻碍,启动子P 开始发生转录,启动反应开始发生转录。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖–即生理上的诱导剂。通常选用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,IPTG 是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

细胞实验

原代细胞培养

凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。

血管生成技术

肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常,且血管基质不完善,这种微血管容易发生渗漏,因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉新的毛细血管性血管的生长。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤,一旦生长直径超过1~2 mm,都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。

线粒体跨膜电位检测

大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关,其中线粒体跨膜电位(MMP)的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体跨膜电位崩溃,则细胞凋亡不可逆转。

细胞周期和凋亡

通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

将Annexin V 进行荧光素标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

细胞迁移

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。检测细胞迁移能力的实验包括划痕实验和Transwell实验。

细胞共培养

细胞共培养是指不同的细胞共同培养。共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化,诱导细胞自身分化,维持细胞功能和活力,对细胞增殖进行调控等。细胞共培养体系包括直接共培养体系和间接共培养体系。直接共培养体系,即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中,不同种类的细胞之间直接接触,研究分泌的细胞因子或直接接触等相互作用方式对细胞的影响;间接共培养体系,即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上,然后将这两种载体置于同一培养环境之中,使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触,从而研究细胞分泌和代谢产生的物质对另一种细胞的影响。

稳定细胞株的筛选

稳定细胞系是指将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。常用物理方法(电转)、化学方法(脂质体等)、生物方法(病毒)。

慢病毒包装

慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒 (HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较长期的表达且安全性高。以慢病毒为媒介,可以用于哺乳动物细胞稳转株系构建,包括基因敲除,knockdown 和 knockin 株系构建。使用慢病毒的方法不但使有效转染的细胞种类增加,而且筛选的基因改造细胞株能稳定遗传。同时可有效地感染普通方法难转染甚至不能转染的细胞,从而达到良好的基因治疗效果。肽德生物主要提供高质量的慢病毒(高滴度、高纯度)服务,应用于临床前细胞学实验和整体动物实验的针对不同基因和药物靶标的各种即用型病毒颗粒。

NTT/CCK8/XTT检测

(a) MTT:
MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂,生成蓝色的甲瓒结晶并沉积在细胞中,甲瓒结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比(死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失,不能还原MTT)。还原生成的甲瓒可溶解在DMSO(二甲基亚砜)中。用DMSO之前要尽量去掉培养液,DMSO溶解甲瓒颗粒,进行比色测定。
(b) CCK-8检测细胞增殖(活力):
CCK-8(cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTT、XTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。
当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。
(c) XTT:
化学名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide,作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色产物。当XTT与电子偶合剂(例如PMS)联合应用时,其所产生的水溶性的产物的吸光度与活细胞的数量成正比。用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤,XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物(formazan)。代谢产物在OD450处有吸收峰。优点:1、使用方便,省去了洗涤细胞;2、检测快速;3、灵敏度高,甚至可以测定较低细胞密度;4、重复性优于MTT。 缺点:XTT水溶液不稳定,需要低温保存或现配现用。

分子生物学服务

荧光定量PCR

实时PCR(real-time PCR),属于定量PCR(Q-PCR)的一种,以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。定量方式包括绝对定量和相对定量。可检测mRNA,microRNA,lncRNA和DNA水平的基因拷贝数变化。

分子克隆及质粒载体构建

分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。

定点突变

定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研究工作中一种非常有用的手段。通过PCR等方法向目的DNA片段(可以是基因组,也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化),包括碱基的插入、删除、转换和颠换等。

单核甘酸多态性

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中,绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象,即SNP,它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式。SNP 技术服务平台包括:测序分型、飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分型、Taqman 探针分型、Multiplex SNaPshot分型等技术平台。

凝胶迁移或电泳迁移率实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

 

蛋白质研究

 

整体实验技术服务

整体实验技术服务分为两种类型:当提供方案时,进行可行性评估并进行报价,然后进行反馈沟通,最终敲定方案执行;当无方案时,根据研究热点和方向进行个性化设计,然后进行沟通从而确定方案。

抗氧化自由基检测

自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团。它是线粒体在电子传递的过程中产生的,正常情况下,机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上,对机体是有利的。但当体内蓄积过量自由基时,就会损伤细胞,导致动物组织或细胞的氧化损伤。在抗氧化研究中,自由基的检测已成为至关重要的一环,得到了广泛的应用。自由基检测的方法多种多样,包括自由基相关酶的测定,化学发光测定,吸光度法等。以SOD检测为例,介绍其主要原理和实验流程。超氧化物歧化酶(SOD)是一种抗氧化剂,其主要功能是清除机体内的自由基。

高效液相色谱技术

蛋白质、多肽等生物分子的高效液相分析,包含蛋白质/多肽的纯度鉴定,蛋白质/多肽的定量分析,天然/合成样品的纯度检测,蛋白质/多肽的指纹图谱分析,单糖/寡糖/多糖定性定量分析,混合物/粗提物分子量分布分析,代谢组分/小分子指纹图谱分析和蛋白/多肽/糖类的少量纯化制备

蛋白质修饰组学技术

常规的蛋白质组学研究往往只关注不同生理、病理条件下蛋白质表达水平的变化。然而,越来越多的研究发现,许多重要的生命活动、疾病发生不仅与蛋白质的丰度相关,更重要的是被各类蛋白质翻译后修饰所调控。因此深入研究蛋白质翻译后修饰对揭示生命活动的机理、筛选疾病的临床标志物、鉴定药物靶点等方面都具有重要意义。常见的蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、泛素化、单甲基化、二甲基化、三甲基化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丁酰化、丙二酰化、戊二酰化修饰等。

  • 蛋白质修饰位点定性分析

蛋白质酶解成肽段后,然后使用蛋白质修饰类泛抗体或生物材料对相应的修饰肽段进行高选择性富集,最后使用高分辨率质谱完成样本的定量分析。

  • 蛋白质修饰组定性定量分析

   蛋白质酶解成肽段后,对肽段进行iTRAQ/TMT标记,然后使用蛋白质修饰类泛抗体或生物材料对相应的修饰肽段进行高选择性富集,最后使用高分辨率质谱完成样本的定量分析。

Western blot

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,是指通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息

ELISA检测

ELISA以免疫学反应为基础,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

酶活性检测

酶活性检测(激酶、酯酶、磷酸酶、脱氢酶、合成酶)是测定人血清或血浆中酶(激酶、酯酶、磷酸酶、脱氢酶、合成酶)的催化活力。常用的有终点法和动力学法。一般采用商品化的试剂盒进行测定。

生物多肽筛选

噬菌体展示技术

近年来,多肽药物已经成为药物研发的热点。多肽药物分子量小,易于穿越人体屏障,其质量控制水平接近于传统的小分子化学药物,而活性接近于抗体类药物,结合了传统小分子化学药物和蛋白质药物的优势,且生产过程中排放的废物少,属于绿色制药范畴,具备广阔的开发前景。目前多肽药物的筛选方法主要包括生化分离天然产物,在现有天然多肽上进行结构修饰等,往往工作量大、筛选效率低。噬菌体展示技术将外源多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合,使随机多肽表达于噬菌体表面,构成了一个肽库,在淘选过程中,某些与靶分子能够特异性结合的噬菌体被保留下来,从而测序得到噬菌体表面的多肽序列。噬菌体展示技术具有较强的目的性,可实现高通量的淘选,多肽易于生产且成本不高,现已广泛应用于生物医药研究的多个领域,尤其在人工抗体和疫苗研制、多肽药物的开发等方面具有广阔的应用前景

病理学实验

苏木精-伊红染色

苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法,石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

石蜡切片冰冻切片

石蜡切片(paraffin section)是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其形态结构。

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间。同时,由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断

免疫组化检测

用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞的定性、定位或定量研究,这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。免疫组化的特点是特异性强、定位准确,因此能够明确目的蛋白的细胞定位、亚细胞定位及多种蛋白之间的相互位置关系。免疫组化在医学上应用广泛,尤其在临床肿瘤诊断和鉴别诊断中具有普遍认可的实用价值。其应用于低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时,准确率可达50% -75%。

免疫荧光实验

免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。

masson染色

Masson染色用于胶原纤维和肌纤维的染色及鉴定;染色结果:胶原纤维呈蓝色、肌纤维呈红色、细胞核呈蓝黑色。

 

抗体的研发与生产

抗体人源化

抗体人源化是指通过DNA重组技术和蛋白质工程技术,将鼠源性单克隆抗体的大部分氨基酸人源化,以降低其异源性,保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性,这种通过重组基因所表达的抗体既有鼠源成分,又有人源成分,所以称为人源化抗体。

多克隆抗体的制备

多克隆抗体存在于免疫动物的血清中,可以从血清中纯化获得。多克隆抗体能识别多个抗原位点,用于多种免疫反应,并且制备时间短,成本低,因此被广泛应用于免疫学研究领域和免疫学诊断领域。

鼠单克隆抗体的制备

单克隆抗体是有杂交瘤细胞产生的能够特异性识别抗原表位的免疫球蛋白。

单克隆抗体的测序

单克隆抗体是有单一B细胞克隆产生的具有某一特定抗原表位的抗体。通过B细胞与骨髓瘤细胞进行融合,生产单克隆抗体是目前最为广泛的技术,但是由于杂交瘤在传代过程中会出现一些不稳定的因素,影响抗体的质量;通过抗体测序获得杂交瘤细胞单克隆抗体的基因序列,进行重组表达获得目标抗体可以保证抗体的稳定性,同时可以有效地必须内源性生物污染。

大规模单克隆抗体生产服务

大规模单克隆抗体的生产目前主要有两种方式,一是腹水制备法,另一种是转瓶培养法。